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干眼颌下腺移植术后泪液蛋白分析

时间:2010年03月04日18:00 来源:好医生网站

【摘要】 目的:分析自体颌下腺游离移植治疗严重干眼术后分泌的泪液蛋白成分及其与正常泪液的异同。方法:收集自体颌下腺游离移植成功后的8例患者的泪液,测定其总蛋白含量及淀粉酶、表皮生长因子(EGF)、分泌性免疫球蛋白A (SlgA)等主要蛋白成分的含量,同时通过不连续的SDS-PAGE蛋白电泳观察其形成的蛋白电泳条带,并与正常人的泪液对比。结果:自体颌下腺游离移植后分泌的泪液总蛋白含量明显低于正常泪液(P<0.05),SlgA含量接近正常泪液(P>0.05),EGF含量高于正常泪液(P<0.05),而其所含的淀粉酶浓度则远高于正常泪液(P<0.05)。SDS-PAGE蛋白电泳显示颌下腺移植术后分泌的泪液与正常泪液具有相似的电泳条带及相近的蛋白成分。

结论 自体颌下腺游离移植术后分泌的泪液具有与正常泪液相近的蛋白成分,但其总蛋白含量较低,淀粉酶含量较高。

【关键词】 颌下腺移植;干眼;泪液蛋白成分

The tear protein component and electrophoresis analysis of severe dry eye treated with submandibular gland transplantation SHAN Xiang-yin, CHEN Jia-qi, LIAO Gui-qing, XU Yang-bin,WANGZhi-chong . Department of Ophthalmology, The 2nd Affliated Hospital.Gruangzhou Medi-cal College, Guangzhou, 510260,China; Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University;Guang Hua Stomatological Hospital,Sun Yat-sen University;The 1st Affilated Hospital,Sun Yat-sen University

【Abstract】 Objective To analysis the tear protein component of severe xerophthalmia treated with submandibular gland(SMG)transplantation. Methods Tears from 8 patients(8 eyes)with a viable SMG graft(SMG tears),as well as normal tears(20 normal subjects/20 eyes).were sampled. Total protein content,secretory immunoglobulin A (SlgA),amylase,epidermal growth factor(EGF)were measured and SDS-PAGE electrophoresis was performed. Results Compared with normal tears,total protein cont-net of SMG tears was lower(P<0.05),SlgA was more similar(P>0.05),but EGF and amylase were higher(P<0.05).SDS—PAGE electrophoresis of SMG tears showed similar protein pattern to normal tears. Conclusions Protein component of tears resulting from SMG transplantation was similar to that of normal tears. but total protein content Was lower, EGF and amylase were higher.

【Key words】 Submandibular gland transplantation; Dry eye; Tear protein component

因外伤、炎症等原因引起的严重干眼是一种灾难性的眼病,尚无理想的治疗方法。近年来开展的自体颌下腺移植术为该类患者的治疗开辟了一条很有希望的治疗途径,但目前报道的不多,而且多数是针对移植腺体分泌功能的探讨。本研究通过生化分析及放射免疫方法测定接受自体颌下腺移植手术的严重干眼患者术后泪液中总蛋白及分泌性免疫球蛋白A (SIgA)、表皮生长因子(EGF)、淀粉酶等主要的蛋白成分含量,并通过不连续的SDS-PAGE蛋白电泳显示其蛋白条带,同时与正常人的泪液进行比较。

材料与方法

1.病例选择:接受自体颌下腺游离移植成功的8例严重干眼患者,其中男性6例,女性2例,年龄17-45岁。5例为化学伤,1例为热烧伤,2例为Stevens-Johnson综合征。所有患者术前均根据干眼的病因、病程和治疗等病史,以及患者干眼的症状描述、眼科检查明确严重干眼的诊断、同时内科风湿科检查、唇腺活检、锝99同位素扫描排除Sjogren’s综合症等伴有涎腺破坏性炎症过程的干眼症。所有患者均自觉眼干症状严重,视力较差,接受过至少1次手术治疗及长期使用l~2种人工泪液且疗效较差,治疗要求较强烈,完全了解该手术的风险、目的及可能出现的并发症,并自愿接受这一手术。手术在气管插管全麻下施行,常规颌下切口游离取出颌下腺,用肝素生理盐水(200ml生理盐水中加肝素125OOu)灌注。然后于面神经前支后面的耳前发际内切开皮肤,于皮下浅筋膜层暴露颞浅动静脉,将领下腺面前静脉及颌外动脉近心端分别与颞浅动脉静脉近心端一端吻合,导管沿颞侧皮下至眼外上穹隆结膜,导管口粘膜与穹隆结膜吻合。移植成功后于颞区皮下可触及质软、边界较清、轻度隆起的腺体,轻轻挤压后即可见清亮分泌液体自位于结膜囊的导管口流出。锝 核素显像示颞区皮下移植腺体及导管显影清晰,泪液分泌明显改善,眼干症状明显改善或消失,视力改善,眼表荧光素及虎红染色明显改善。

  2.泪液收集:用毛细虹吸管置于泪湖处收集颌下腺移植术后及正常人群自愿者的泪液约100ul,置于消毒的EP管内,立即储存于-80摄氏度低温冰箱中待集中测定。由于接受颌下腺移植的严重干眼患者术前泪液分泌极少及术后3月内泪液分泌也较少且不稳定,故只收集手术3月后的泪液进行分析,正常人群对照者共20人,男l4人,女6人,年龄20~30岁,泪液分泌试验(SIT)(I)值≥15mm,其外眼检查及裂隙灯检查未发现明显的眼表疾病,无角膜接触镜配戴史及眼局部用药病史。

  3.泪液蛋白测定:泪液总蛋白、淀粉酶的含量采用柯达干化学分析仪(型号为VITROS 950)进行分析,检测干片均为柯达公司提供的同类产品,按常规的检测方法和程序进行检测。分泌型免疫球蛋白、表皮生长因子则采用放射免疫法进行测定,放免试剂盒为中国原子能科学院同位素研究所提供。

4.泪液蛋白电泳分析:采用不连续SDS—PAGE电泳法对颌下腺移植术后1周、4月及正常泪液标本进行蛋白质组分分析,并根据其分子量判断其蛋白类型。低分子量标准蛋白(Mark):中国科学院上海生化研究所制备,具体蛋白如下:兔磷酸化酶B (分子量为97,400道尔顿),牛血清白蛋白(分子量为66,200道尔顿),兔肌动蛋白(分子量为43000道尔顿),牛碳酸酐酶(分子量为3l,000道尔顿),胰蛋白酶抑制刹(分子量为20,l00道尔顿),鸡蛋白溶菌酶(分子量为14,400道尔顿),微型双垂直板电泳槽(Mini-Protein i3Dual Slab Cell,Bio-Rad),恒压恒流电泳仪(DF-D型,北京东方仪器厂)

  结 果

  1. 颌下腺移植术后的泪液主要蛋白成分

由表l可以看出,颌下腺移植后3月的颌下腺泪液总蛋白含量低于正常泔液(P<0.O5),SIgA含量接近正常泪液(P>0.O5).EGF含量高于正常泪液(P<0.O5),而其所含的淀粉酶浓度则远高于正常泪液(P<0.05) 、

表1 颌下腺移植术后泪液主要成分与正常泪液的比较(均数间的t榆验)

2. 自体颌下腺移植术后泪液蛋白电泳

结果见图2,其中第1条带为低分子量标准蛋白(分子量范围是14,400~97,400道尔顿),第2条带为正常泪液,第3条带为术后第4天的泪液,第四条带为术后4月的泪液。从电泳带上可以看出,正常泪液与颌下腺移植术后泪液所见的电泳条带相似,参考Chi-ho To根据泪液蛋白分子量所作的蛋白带的鉴定,由上至下(1~8)的蛋白带分别为如下蛋白:SIgA,乳铁蛋白,人血清白蛋白(HAS),未知蛋白,G蛋白,未知蛋白组,泪液特异性的前白蛋白,溶菌酶。除了第4条带外,颌下腺移植术后泪液的其余条带均较正常泪液窄,颜色也较淡。而术后第4天的电泳条带又较术后4月的为淡。

讨 论

干眼是多因素引起的一类疾病,目前主要的治疗方法是使用人工泪液,但由于人工泪液与正常泪液成分相差甚远,严重干眼泪液的极度缺乏和眼表的严重破坏,使人工泪液对严重干眼只能起到缓解眼干症状的作用,而无明显的治疗效果,不能阻止眼表的进一步恶化。而严重干眼患者在清醒期间需频繁地滴眼,严重影响了患者的生活质量,久之甚至会成为一种不堪忍受的痛苦。因此寻找一种与泪液成分相似、自体源源不断分泌的内源性液体将是治疗严重干眼的理想方式。基于寻找到一种混合性分泌腺体及显微外科技术的发展,使自体颌下腺游离移植成为可能。初步的实验及临床研究均显示游离移植后长期成活的颌下腺保持着正常的腺体结构及持续的分泌功能,但目前国内外对移植后分泌液的成分,尤其是其中对眼表结构较重要的蛋白成分的研究较少。因为泪液是一种成分复杂的溶液,包括水分、蛋白质、免疫球蛋白、生长因子、脂类、各种代谢产物和脱落的上皮及多形核细胞,其中的蛋白成分包括粘蛋白、细胞生长因子、免疫球蛋白、溶菌酶等在润泽眼表、形成稳定的泪膜、维持眼表上皮正常代谢、细胞表型、损伤修复及屈光诸方面有着重要作用,是非常重要的活性成分。因此探讨游离移植后长期成活的颌下腺分泌后形成的“泪液” 中的蛋白成分及其与正常泪液的区别,对进一步观察和分析其对眼表的影响具有十分重要的意义。本研究即通过生化检测、放射免疫测定等方法分析自体颌下腺游离移植后长期存活的腺体分泌成分中总蛋白含量及淀粉酶、SIgA、EGF等活性蛋白成分含量,并通过SDS-PAGE蛋白电泳显示其分泌液中的蛋白条带和成分,同时与正常泪液进行比较。结果显示自体颌下腺游离移植后分泌的泪液总蛋白含量明显低于正常泪液(P<0.05),SIgA含量接近正常泪液(P>0.05),而其所含的淀粉酶浓度则远高于正常泪液(P<0.05):这与Geerling等以及李晓新等报道的相似 我们通过放射免疫的方法测定出EGF含量高于正常泪液(P<0.05),而Geerling等尚发现颌下腺移植后泪液中的溶菌酶较正常泪液高29倍,SlgA在术后3月时接近正常泪液,而在以后的2年随访中保持稳定:虽然正常泪液的总蛋白含量较高,而我们经蛋白电泳分析可见其蛋白质条带与移植颌下腺的泪液相似,根据其分子量可分别判断出SlgA、溶菌酶、乳铁蛋白等重要的抗感染成分即其昕含的蛋白活性成分相似。而且由图2也可看出移植后4天与移植后4个月的泪液蛋白电泳条带极为相似,只是4天时的泪液蛋白电泳条带较4月时的为淡,4月时的蛋白电泳条带更接近正常泪液,这主要是因为自体颌下腺游离移植后的一些分泌变化规律有关。我们观察到在刚施行手术后的1~2天内,移植腺体分泌较少,但之后多数会出现明显的分泌增多,一天中有数小时,有大量的分泌液自眼角流出,持续2~3天后又逐渐明显减少,之后一直保持在低分泌状态,泪液分泌量虽然较术前增多,但多数达不到正常泪液分泌量,不过挤压移植腺体区仍可见较多清亮的分泌液流出,锝 同位素显影示移植腺体成活。直至术后3个月左右,泪液分泌量又明显增多,但不是以前的持续流出,而是更接近于正常泪液的分泌量,所测得的基础分泌值多数达到或超过正常水平,而且这一分泌特征在所随诊的1~2年内基本不变。因此其术后4天的分泌液主要为正常颌下腺的分泌液,而移植后4月的分泌液为去神经支配的腺体分泌液,其蛋白成分更接近正常泪液,是否是腺体生存环境的改变及失去神经支配后腺体分泌成分本身的改变尚需进一步研究和观察。表皮生长因子首先由颌下腺组织中分离出,颌下腺组织是人体内表皮生长因子的主要来源之一,本研究证实颌下腺移植成功后的泪液中EGF含量高于正常泪液,这有利于眼表组织的损伤修复。过去有人担心淀粉酶会损伤眼表,但我们经放射免疫测定发现,其实正常泪液中也含有一定浓度的淀粉酶,只是低于颌下腺分泌液。实际上,Bennet已于1969年在活体证明唾液淀粉酶没有溶解蛋白和磷脂的活性,因而不会损害角膜和结膜上皮的糖蛋白和磷脂。进一步的研究发现唾液淀粉酶是一种仅作用于多糖的酶,可以通过作用于细菌细胞壁的多糖链(如奈瑟球菌素)而达到溶菌的效果,因此不仅不会损伤眼表结构,还具有保护眼表防止细菌感染的作用。此外颌下腺移植后泪液中较高的淀粉酶含量尚可作为移植颌下腺存活并有良好分泌活性的标志。颌下腺为含有浆液和粘液的混合腺体,其中的粘蛋白成分对形成眼表的泪膜结构十分重要,但由于其分子量较大, 目前尚无直接的定量测定方法,可通过测定泪膜破裂时间和泪液蕨样结晶形态间接判断,我们将在另文中论述。

总之,颌下腺移植后的泪液蛋白成分与正常泪液相似但又有所不同,同时又不同于正常颌下腺分泌液,这主要是眼表残存细胞的分泌与颌下腺分泌共同影响的结果。一方面去神经支配长期存活的颌下腺自身分泌成分可能会有所改变,另一方面也存在着眼表结膜残存的杯状细胞、炎症破坏血一泪屏障以及残存的睑板腺的分泌等因素,这些因素改变着移植颌下腺术后的“泪液”蛋白成分使之更接近于正常泪液。移植颌下腺术后形成的泪液中所含的较高浓度的淀粉酶、溶菌酶、SIgA等成分具有局部抗感染的作用,同时这些成分也具有保持眼表张力和泪液粘性的作用,是任何人工泪液所无法比拟的。当然这些蛋白成分的差异是否会对眼表结构造成不良影响尚需进一步观察。

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